Immagine Intensità Processing luminosità è la percezione visiva della luce riflessa. Aumento della luminosità si riferisce a un aumento delle immagini luminanza. Il contrasto è la separazione delle parti più chiare e più scure di un'immagine. Un aumento di contrasto si scurisce le ombre e alleggerire luci. Aumentando il contrasto viene generalmente usato per fare oggetti in un'immagine più distinguibili. Regolare la luminosità e il contrasto con Regolazione immagine BrightnessContrast. per rendere visualizzazione dell'immagine facile. Premere il pulsante Auto per applicare un tratto intelligente del contrasto alla visualizzazione dell'immagine. Luminosità e contrasto viene regolato tenendo conto della immagini istogramma. Se premuto ripetutamente il pulsante aumenta la percentuale di pixel saturi. Il pulsante Reset rende la massima 0 e il minimo 255 in immagini a 8 bit e il massimo e minimo pari ai valori dei pixel più piccoli e più grandi nelle immagini istogramma di immagini a 16 bit. Se il pulsante Auto non produce un risultato desiderabile, utilizzare lo strumento regione-di-interesse (ROI) per selezionare parte della cellula e un po 'di fondo, poi ha colpito di nuovo il pulsante Auto. Il tratto sarà quindi basata sulle intensità della ROI. Premendo il pulsante Applica le modifiche in modo permanente i valori effettivi di grigio dell'immagine. Se solo analizzando l'intensità dell'immagine non premere questo pulsante. Se si preferisce l'immagine da visualizzare come il nero su bianco piuttosto che nero su bianco, quindi utilizzare il comando invertita: Tabelle Immagine Lookup Inverti LUT. Il comando Modifica Inverti inverte il pixel stessi valori in modo permanente. Ottenere valori di intensità da sola ROI Se si lavora con una pila, il ROI selezionata può essere analizzato con il comando: Immagine Pile Plot Z Axis profilo. Questo genera una singola colonna di numeri - una intensità fetta per riga. Le prime 6 righe della colonna sono dettagli del ROI. Questo assicura lo stesso ROI non viene analizzato due volte e consente di salvare qualsiasi interessante ROI. I dettagli sono composti da zona, coordinata x, y coordinata, AR, rotondità, e la solidità del ROI. Se la ROI è una ROI polylinegtfreehand piuttosto che un squaregtoval, agisce come se il ROI è un ovalgtsquare. L'(ovale) ROI può essere ripristinato inserendo i dettagli spinto dalla selezione Edit ripristino di selezione (tasto di scelta rapida: Ctrl-Shift-E) di comando. I risultati vengono visualizzati in una trama-finestra con i dettagli ROI nel titolo della finestra trama. La trama contiene l'elenco pulsanti, salvare, copiare. Il pulsante Copia mette i dati negli appunti in modo che possa essere incollato in un foglio di Excel. Le impostazioni per il pulsante di copia si trovano sotto Modifica Opzioni Opzioni profilo di stampa. Impostazioni consigliate sono: non salvare valori x (impedisce la fetta di dati numerici di essere incollati in Excel) e Autoclose in modo che non dovete chiudere la trama analizzato ogni volta. intensità dinamica vs analisi Tempo Il plugin Plot asse Z Profilo (questa è la Z Profiler da Kevin (Gali) Baler (gliblr a yahoo) e Wayne Rasband semplicemente rinominato) controllerà l'intensità di un ROI in movimento utilizzando uno strumento di monitoraggio di particelle. Questo strumento può essere manuale o automatica. Utilizzare le Immagini Plot asse Z comando Profilo stack. Come valori di intensità da più ROI è possibile analizzare più ROI in una volta con Bob Doughertys Multi plug Misura. La funzione nativa ROI direttore fa un lavoro simile, tranne l'incaricato di tirare generare i risultati in colonne ordinate. Controllate il sito Bobs per gli aggiornamenti. Il plugin Misura Multi che viene fornito con l'installazione è v3.2. Aperto confocale-serie e rimuovere lo sfondo (Vedere Correzione del fondo) Genera una pila di riferimento per l'aggiunta di ROI. Utilizzare la funzione Z-progetto Stacks Image e selezionare la media. Rinominare questa immagine qualcosa di memorabile. Aprire il plugin ROI Manager (Analyze Strumenti Roi Manager o l'icona della barra degli strumenti). Selezionare ROI e Aggiungere al gestore ROI. Fare clic sul pulsante Mostra tutto per evitare l'analisi della stessa cella due volte. Dopo aver selezionato le ROI da analizzare nell'immagine di riferimento, è possibile disegnare l'immagine di riferimento facendo clic sul pulsante Moregtgt e selezionando Draw. Salvare l'immagine di riferimento per la cartella esperimenti di dati e quindi fare clic sulla pila da analizzare. Fare clic sul pulsante Moregtgt nel gestore ROI e selezionare il pulsante Multi Misura per misurare tutto il ROI. Fare clic su OK. Questo metterà i valori da ogni fetta in una singola riga con più colonne per fetta. Cliccando su Misura tutti i 50 fette metterà tutti i valori di tutte le sezioni e ciascuna ROI in una singola colonna. Passare alla finestra Risultati e selezionare la voce di menu Modifica Seleziona tutto. . Poi EditCopy. Vai a Excel e incollare i dati. Controllare che tutto è stato incollato correttamente 10. Per copiare le coordinate ROI nel foglio di calcolo di Excel, ci deve essere una riga vuota sopra i dati di intensità. Utilizzare la finestra di Multi Misurare e fare clic sul pulsante Copia elenco. 14. In Excel, fare clic sulla cella vuota sopra la prima colonna di dati e incollare le coordinate ROI. Salvare le ROI con il pulsante Multi Measure Salva. Metteteli nella cartella dei dati sperimentali. Il ROI può essere aperto in seguito individualmente con il pulsante Apri o tutti in una volta con il pulsante Apri tutto. Ovali e rettangolari ROI possono essere ripristinati singolarmente da x, y, l, valori h con il ROI Plugin Specificare ROI. comando. l'imaging Raziometrico confronta le registrazioni di due segnali diversi per vedere se ci sono delle somiglianze tra loro. È fatto dividendo un canale da un altro canale per produrre un terzo canale raziometrico. Questa tecnica è utile perché corregge perdite dye, disuguale dye carico e fotometabolismo. Un esempio di applicazione potrebbe essere la misura di ioni, pH, e le dinamiche di tensione intracellulari in tempo reale. Sfondo sottrazione è necessario prima analisi di immagini di rapporto a doppio canale. Vedi anche la sezione correzione del fondo. Il plugin RatioProfiler eseguirà l'analisi raziometrica di un singolo ROI su una pila interlacciato a doppio canale. The Odd-fette sono canale 1 immagini e le fette sono anche canale 2 immagini. Se i due canali sono aperti come pile separate, quali Zeiss, i due canali possono essere interlacciati (mescolati insieme alternando tra loro) con il comando di menu Plugins Stacks - Mischiare le carte Stack Interleaver. Il plugin genererà un verde-plot dei valori di rapporto. Ch1Ch2 è l'impostazione predefinita e si può ottenere Ch2Ch1 se il plugin viene eseguito con il tasto Alt. Sarà anche generare un secondo diagramma delle intensità dei singoli canali, CH1 e CH2, nonché una tabella dei risultati. La prima riga della tabella dei risultati contiene valori per x, y, la larghezza e l'altezza della ROI. Dalla seconda fila verso il basso, la prima colonna è il tempo (numero slice), la seconda colonna è la Ch1 intensità media, e il terzo canale è il Ch2 intensità media e il valore del rapporto. Lo stack deve avere il suo intervallo di trama tarato in modo che il valore Tempo di essere in secondi. In caso contrario, si tratta di fette. L'intervallo di telaio può essere impostato per lo stack tramite il menu delle proprietà comando Immagine. Questa tabella può essere copiato negli appunti e incollato altrove con la Edit Copia tutto comando di menu. Analisi rapporto utilizzando direttore ROI 1.Subtract lo sfondo dall'immagine. 2. Aprire ROI manager (Analisi Strumenti direttore ROI.) E fare clic sul pulsante Mostra tutto. 3. Selezionare le celle da analizzare e aggiungerli al gestore ROI (tasto o il tasto T della tastiera Aggiungi). 4. Eseguire il plugin. La finestra del risultato contiene la media di CH1 e CH2 e il loro rapporto. Ogni riga è un timepoint (slice). La prima riga contiene i dettagli ROI. Per generare un'immagine di riferimento: Appiattire lo stack con il comando di menu (Immagine Stacks Z-progetto con il tipo di proiezione: Massimo), regolare la luminosità e il contrasto, se necessario. Selezionare la nuova immagine e fare clic sul pulsante Altro nel gestore ROI. Dopo di che selezionare Etichetta. Ottenere dati timestamp La LSM Toolbox è un progetto che mira all'integrazione di funzioni utili comuni di tutto il formato di file Zeiss LSM, che dovrebbe migliorare la fruibilità dei file LSM confocale conservati nel loro formato nativo, preservando in tal modo tutti i metadati disponibili. Nelle Figi, i comandi corrispondenti sono: File Importa Visualizza LSMToolbox che visualizza la casella degli strumenti, da cui tutti i comandi possono essere richiamati e aiuto su plugin LSMToolbox. che visualizza informazioni sul plugin. Questa lettura può essere trovata utilizzando il comando di menu Immagine Informazioni. . Scorrere verso il basso per ottenere il tempo ogni fetta è stata acquisita. Selezionare questa volta, copiarlo in Excel, e trovare il numero di tempo ottenuto utilizzando il comando di menu di Excel Modifica Sostituisci. Questo lascerà solo i dati temporali. Il tempo trascorso può quindi essere calcolato sottraendo la riga 1 da tutte le righe successive. Linescanning comporta l'acquisizione di una singola linea, un pixel in larghezza, da un microscopio confocale comune invece di immagine 2D standard. Questo è di solito un modo più veloce per prendere un'immagine. Tutte le singole immagini a livello di pixel sono poi impilati per ricreare l'immagine 2D. Una generazione pseudo-linescan di un'immagine 3-D (x, y, t). È utile per la visualizzazione di dati 3-D in 2 dimensioni. Una linea di interesse viene disegnata seguita dal comando: Immagine Pile reslice o con il tasto della tastiera. Ti verrà chiesto per la larghezza della linea che si desidera essere mediati. Esso genera una pila pseudo-linescan con ogni fetta rappresenta la pseudo-linescan di un'ampia linea di un solo pixel lungo la linea di interesse. Media lo stack pseudo-LineScan selezionando Immagine Stacks Z-Project. e utilizzare il comando media. Un poli-linea può essere utilizzato, ma questo genererà una sola fetta pixel. impostazioni predefinite Fijis per scontato che le pile sono z - serie piuttosto che t - serie. Ciò significa che molte funzioni relative alla terza dimensione di una pila di immagini sono indicati con z. Basta tenere questo in mente. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Analisi Il profilatore plug FRAP analizzare l'intensità di una ROI sbiancato nel tempo e normalizzare contro l'intensità della cellula intera. Dopo che troverà l'intensità minima nella ROI sbiancato e montare il recupero con questo punto in mente. Aprire il manager ROI. Disegnare intorno al ROI sbiancato e aggiungerlo al gestore ROI. Disegnare attorno tutta la cella e aggiungere che al gestore ROI. La normalizzazione corregge per la sbianca che si verifica durante l'acquisizione dell'immagine e assume l'intera cella è nel campo di vista. Il plugin assume il maggiore dei due ROI nel gestore ROI è tutta ROI cellulare e che il ROI più piccola è la parte sbiancato. Eseguire il plugin FRAP profiler. Il plugin restituirà l'intensità grafico reale, l'intensità normalizzata grafico reale della zona sbiancato, e l'adattamento della curva. Non lineare contrasto si estende equalizzazione È possibile avere un maggiore controllo sulla regolazione di luminosità e contrasto con il processo di comando di menu contrasto Migliora. Con uno stack, analizza l'ciascuna fette istogramma per effettuare la regolazione. Il comando equalizza contrasto applica un tratto non lineare dell'istogramma basato sulla radice quadrata della sua intensità. Gamma esegue una regolazione istogramma non lineare. oggetti deboli diventano più intensi, mentre oggetti luminosi non lo fanno (LT1 gamma). Inoltre, di media intensità oggetti diventano più debole mentre gli oggetti luminosi non (gamma GT 1). L'intensità di ciascun pixel viene elevato alla potenza del valore gamma e quindi scalata a 8 bit o minimo e massimo di immagini a 16 bit. Per 8 immagini bit nuova intensità 255 (vecchio intensity255) Gamma Gamma può essere regolata tramite il comando Process Math Gamma. Essa vi permetterà di regolare la gamma con la barra di scorrimento. Fare clic su Ok quando si è finito. È possibile utilizzare la barra di scorrimento per determinare il valore di gamma desiderato su una fetta del tuo stack. C'è anche la possibilità di visualizzare in anteprima i risultati. Vedere il riferimento on-line per una spiegazione dei filtri digitali e come funzionano. I filtri possono essere trovati utilizzando il menu Filtri di comando di processo. . Media filtro. il pixel viene sostituito con la media di sé e suoi vicini all'interno del raggio specificato. La voce di menu Processo Smooth è un filtro media 33. filtro gaussiano. Questo è simile a un filtro di livellamento ma invece sostituisce il valore del pixel con un valore proporzionale a una distribuzione normale dei suoi vicini. filtro mediano. Il valore di pixel viene sostituito con la mediana di se stesso e dei suoi vicini adiacenti. Questo rimuove il rumore e preserva i confini meglio di semplice filtrazione media. Il rumore voce di menu Processo Smacchia è un filtro mediano 33. Filtro convolve: Questo permette a due array di numeri per essere moltiplicati insieme. Le matrici possono essere di dimensioni diverse, ma devono essere della stessa dimensione. In analisi dell'immagine questo processo viene generalmente utilizzato per produrre un'immagine di output in cui i valori dei pixel sono combinazioni lineari di certi valori di ingresso. Minimo: Questo filtro, noto anche come filtro erosione, è un filtro morfologica che considera la zona attorno a ciascun pixel e, da questo elenco di vicini, determina il valore minimo. Ogni pixel dell'immagine viene poi sostituito con il valore risultante generato da ogni zona. Massima: Questo filtro, noto anche come un filtro dilatazione, è un filtro morfologica che considera la zona attorno a ciascun pixel e, da questo elenco di vicini, determina il valore massimo. Ogni pixel dell'immagine viene poi sostituito con il valore risultante generato da ogni zona. filtro di Kalman. Questo filtro, noto anche come Linear Quadratic stima, opera ricorsivamente su ingressi rumorosi per calcolare una stima statisticamente ottimale dello stato del sistema sottostante. correzione del fondo può essere fatto in diversi modi. Un metodo semplice è quello di utilizzare le tabelle immagine Lookup HiLo LUT per visualizzare valori zero come valori blu e bianco (valore di pixel 255) come rosso. Con un background che è relativamente anche attraverso l'immagine, rimuoverlo con il comando BrightnessContrast aumentando lentamente il valore minimo fino a quando la maggior parte dello sfondo blu viene visualizzato. Premere il pulsante Applica per apportare una modifica permanente. Rolling-Ball correzione del fondo per fissare un fondo irregolare utilizzare il comando di menu Processo Sottrai sfondo. Questo userà un algoritmo palla che rotola su sfondo uniforme. Il raggio deve essere impostato almeno alla dimensione dell'oggetto più grande che non fa parte dello sfondo. Può anche essere usato per rimuovere sfondo da gel in cui lo sfondo è bianco. L'esecuzione più volte di comando può produrre risultati migliori. L'utente può scegliere se avere o meno uno sfondo chiaro, creare uno sfondo senza sottrazione, hanno un paraboloide scorrevole, disabilitare levigatura, o visualizzare in anteprima i risultati. Il valore di default per il raggio della sfera rotolante è di 50 pixel. Processo di perdita di Sottrarre Background. Tau Patologia Induce Excitatory Neuron, griglia delle cellule disfunzione e memoria spaziale deficit ricorda malattia di Alzheimer precoce Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y . Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4,. Karen E. Duff 1,2,3,5,. 1 Taub Istituto per la ricerca sulla malattia di Alzheimer e il cervello di invecchiamento, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Dipartimento di Patologia e Biologia Cellulare, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Dipartimento di Neuroscienze Integrativa , New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA ha ricevuto 20 luglio 2016, riveduta 20 ottobre 2016. accettata il 15 dicembre 2016. Disponibile online il 19 gennaio 2017. Pubblicato: 19 gen 2017 in evidenza Tau patologia induce deficit di memoria spaziale nel vecchio , ma non giovane, topi EC-Tau Aged EC-Tau ipoattività topi mostra cella della griglia e ha ridotto la periodicità eccitatori, ma non inibitorio, i neuroni MEC sono vulnerabili alla patologia tau Altered attività neuronale correla con la neurodegenerazione nella vecchia EC-Tau Le prime fasi del morbo di Alzheimer malattia (AD) sono caratterizzate dalla formazione di grovigli maturi nella corteccia entorinale e disorientamento e confusione durante la navigazione luoghi familiari. La corteccia entorinale mediale (MEC) contiene neuroni specializzati chiamati celle della griglia che fanno parte del sistema di navigazione spaziale. Qui vi mostriamo in un modello di topo transgenico che esprime mutante tau umana prevalentemente nella CE che la formazione di grovigli maturi nel vecchio topi è stato associato a perdita eccitatorio cellulare e deficit nella funzione delle cellule di griglia, inclusi i campi della griglia destabilizzato e tassi di cottura ridotti, così come attività di rete alterata. Overt patologia tau in topi anziani è stata accompagnata da deficit di memoria spaziale. Pertanto, tau patologia avviato nella corteccia entorinale potrebbe portare a deficit di cottura cella della griglia e alla base del deterioramento della cognizione spaziale visto in AD umana. tau patologia malattia di Alzheimer entorinale celle della griglia corteccia perdita neuronale deficit cognitivi neurofibrillari grovigli elettrofisiologia memoria spaziale ipoattività Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4.November 04 2010 Le seguenti informazioni è una versione aggiornata di un metodo per l'utilizzo di ImageJ per analizzare occidentale macchie da una pagina più vecchio ormai deprecato. Se you8217re alla ricerca di una soluzione del flusso di lavoro più completo per il Western Blot analisi, si prega di visitare il mio tutorial sull'uso Immagine Studio Lite. un pacchetto di software libero da LI-COR Biosciences. L'immagine software Studio Lite può essere scaricato gratuitamente dal licorislite. In aggiunta alle funzionalità descritte di seguito per ImageJ, Immagine Studio Lite fornisce la gestione dei dati aggiuntivi presenta insieme a strumenti di annotazione per la produzione di immagini pronti per la pubblicazione dei vostri western. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) può essere utilizzata per confrontare la densità (alias intensità) delle bande su gel di agar o western blot. Questo tutorial presuppone che si è svolto il vostro gel o macchia attraverso il passo di visualizzazione, in modo da avere un'immagine digitale del gel in. tif. jpg. png o altri formati di immagine (a 16 bit tif sarebbero il formato preferito mantenere la massima quantità di informazioni nell'immagine originale). Se si esegue la scansione di pellicola a raggi x su uno scanner piano, assicurarsi di utilizzare uno scanner con la possibilità di eseguire la scansione di lucidi (cioè film), e utilizzare il software dello scanner per salvare le immagini TIFF a 16 bit. Vedere i riferimenti alla fine di questo tutorial per una discussione sui vari modi in cui si può avvitare questo passo. Ciò presuppone anche che si didn8217t sovraesposto l'immagine macchia quando si ha prodotta. Per una spiegazione del motivo per cui sovraesposizione rovinerà i risultati, consultare questa pagina. Il metodo descritto qui utilizza il metodo di analisi Gel descritto nella documentazione ImageJ: Analisi del gel. Si può preferire di usare al posto dei metodi delineare qui di seguito. Ci dovrebbe essere molto piccola differenza tra i risultati ottenuti con i diversi metodi. Questa versione del tutorial è stata creata usando ImageJ 1.42q su un Windows 7 64-bit installazione. 1. Aprire il file immagine utilizzando FilegtOpen in ImageJ. 2. La routine di analisi di gel richiede l'immagine di essere un'immagine in scala di grigi. Il metodo più semplice per convertire in scala di grigi è quello di andare a ImagegtTypegt8 bit. La tua immagine dovrebbe apparire come Figura 1. Figura 1. Un'immagine Western Blot aperto in ImageJ fabbricato. Le informazioni lungo la parte superiore dell'immagine indica che l'immagine è attualmente in modalità 8 bit, utilizzando un LUT invertente (look-up table). La LUT inversione assicura che le bande scure vengono registrati come valori di densità più elevate. 3. Scegliere lo strumento selezioni rettangolari dalla barra degli strumenti ImageJ. Disegnare un rettangolo intorno alla prima corsia. ImageJ presuppone che il corsie corrono verticalmente (in modo singole bande sono orizzontali), in modo che il rettangolo dovrebbe essere alto e stretto per racchiudere una sola corsia. Se si disegna un rettangolo che è corto e largo, ImageJ passerà ad assumere le corsie gestite in orizzontale (singole bande sono verticali), che porta a molta confusione. Figura 2. La prima corsia è stata selezionata con lo strumento Selezione rettangolare 4. Dopo aver disegnato il rettangolo sopra la prima corsia, premere il 1 (Comando 1 su Mac) (Comando 1 su Mac) o andare a AnalyzegtGelsgtSelect prima corsia per impostare il rettangolo in atto. Il 1 ° corsia sarà ora messo in luce e hanno un 1 nel mezzo di esso. 5. Usa il mouse per fare clic e tenere al centro del rettangolo al 1 ° corsia e trascinarlo verso la corsia. È inoltre possibile utilizzare i tasti freccia per spostare il rettangolo, anche se questo è più lento. Centrare il rettangolo sopra la corsia di sinistra a destra, ma don8217t preoccuparsi allineandola perfettamente sullo stesso asse verticale. Immagine-J allineerà automaticamente il rettangolo sullo stesso asse verticale è la 1 rettangolo nel passaggio successivo. 6. Premere 2 (Comando 2 su Mac) o andare a AnalyzegtGelsgtSelect corsia per impostare il rettangolo in atto nel corso del 2 ° corsia. A 2 apparirà nella corsia quando il rettangolo è posto. 7. Ripetere i passaggi 5 6 per ogni successivo corsia sul gel, premendo 2 (Comando 2 su Mac) ogni volta per impostare il rettangolo in posizione (figura 3). Figura 3. Posizionare il rettangolo sopra ogni corsia, premendo 2 ogni volta per impostare il rettangolo in atto. 8. Dopo aver impostato il rettangolo in atto l'ultima corsia (premendo 2), premere 3 (Comando 3 su Mac), o andare a AnalyzegtGelsgtPlot Lanes di tracciare un grafico di profilo di ogni corsia. Figura 4. La trama profilo dall'esempio Western Blot. 9. La trama profilo rappresenta la densità relativa del contenuto del rettangolo sopra ogni corsia. I rettangoli sono disposti dall'alto verso il basso sulla trama profilo. Nell'immagine western blot esempio, i picchi del grafico di profilo (Figura 4) corrisponde alle bande scure dell'immagine originale (Figura 3). Perché c'erano quattro corsie selezionati, ci sono quattro sezioni nel grafico di profilo. i picchi più alti rappresentano bande scure. picchi più larghe rappresentano gruppi che coprono un intervallo di dimensioni più ampia sul gel originale. 10. Immagini di gel reali o macchie occidentali avranno sempre qualche segnale di fondo, in modo che i picchi don8217t arrivano fino alla linea di base della trama profilo. La figura 5 mostra un picco da un vero blot dove c'era il rumore di fondo, in modo che il picco sembra galleggiare sopra la linea di base del grafico di profilo. Sarà necessario chiudere il picco in modo da poter misurare la sua dimensione. Figura 5. Western blot reali hanno spesso qualche rumore di fondo, in modo che il picco doesn8217t raggiungere fino alla linea di base (bianco perfetto). 11. Scegliere lo strumento di selezione linea retta dalla barra degli strumenti ImageJ (Figura 6). Per ogni picco si desidera analizzare nella trama profilo, tracciare una linea attraverso la base del picco per racchiudere il picco (Figura 5). Questo passaggio richiede un po 'di giudizio soggettivo da parte vostra per decidere dove finisce il picco e il rumore di fondo comincia. Figura 6. Utilizzare lo strumento linea retta per chiudere la base di ogni picco di interesse. Figura 7. Il picco della Figura 5 è indicata con una linea tracciata attraverso la base del picco per racchiudere l'area del picco. 12. Si noti che se si hanno molti corsie evidenziate, le corsie successive saranno nascosti nella parte inferiore della finestra profilo trama. Per vedere questi vicoli, premere e tenere premuto la barra spaziatrice, e utilizzare il mouse per fare clic e trascinare la trama profilo verso l'alto. 13. Quando ogni picco è stato chiuso alla base con lo strumento di selezione linea retta, selezionare lo strumento Bacchetta dalla barra degli strumenti ImageJ (Figura 8). Figura 8. Scegliere lo strumento Bacchetta per evidenziare ogni picco di interesse sulla trama profilo. 14. Utilizzando la barra spaziatrice e il mouse, trascinare la trama profilo verso il basso fino a tornare alla prima corsia. Con lo strumento Bacchetta, fare clic all'interno del picco (Figura 9). Ripetere questa operazione per ogni picco, come si va giù la trama profilo. Per ogni picco che si evidenzia, le misure devono pop-up nella finestra Risultati che appare. Figura 9. Fare clic all'interno della 1 ° picco di interesse con lo strumento bacchetta. Il picco dovrebbe essere evidenziata e una misura dovrebbe sollevarsi nella finestra Risultati. 15. Quando tutti i picchi sono stati evidenziati, vai a AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Questa etichette ogni picco con la sua dimensione, espressa come percentuale della dimensione totale di tutti i picchi evidenziati. 16. I valori della finestra Risultati (Figura 10) possono essere spostati in un foglio di calcolo selezionando EditgtCopy Tutto nella finestra Risultati. Incollare i valori in un foglio di calcolo. Figura 10. L'uscita dalla selezione picchi nella trama profilo e l'etichettatura dei picchi. In questo caso, i risultati sono dalla selezione la banda superiore in ciascuna delle 4 corsie nell'esempio Western Blot dalla Figura 1. Nota: Se si fa clic accidentalmente nel posto sbagliato con la bacchetta. il programma ancora record che cliccato zona come un picco, e sarà fattore nella superficie totale utilizzata per calcolare i valori percentuali. Ovviamente questo inclinare i risultati se si fa clic in aree che aren8217t picchi. Se vi capita di fare clic nel posto sbagliato, semplice andare a AnalyzegtGelgtLabel Peaks per tracciare i risultati attuali, che visualizza i valori non corretti, ma ancora più importante reimposta il contatore per la finestra dei risultati. Torna alla trama profilo e iniziare cliccando all'interno dei picchi di nuovo, a partire dal 1 ° picco di interesse. La finestra Risultati deve cancellare e iniziare a mostrare i nuovi valori. Quando you8217re sicuro you8217ve clic in tutte le cime corretti senza fare clic accidentalmente in tutte le aree sbagliate, si può tornare a AnalyzegtGelsgtLabel Peaks e ottenere i risultati corretti. Analisi dei dati con i dati incollati in un foglio di calcolo, è ora possibile calcolare la densità relativa dei picchi. Come promemoria, i valori calcolati da ImageJ sono essenzialmente numeri arbitrari, che hanno significato solo nel contesto della serie di picchi che è stata selezionata l'immagine singola gel you8217ve lavorato in su. Essi non hanno unità di g di proteine o di altre unità del mondo reale che si può pensare. La procedura normale è quello di esprimere la densità delle bande selezionate relative a qualche banda standard che è stato selezionato anche durante questo processo. 1. Mettere i dati in un foglio di calcolo. Uno dei picchi dovrebbe essere il vostro standard. In questo esempio we8217ll utilizzare il 1 ° picco come standard. 2. In una nuova colonna accanto alla colonna Percent, dividere il valore percentuale per ogni campione per il valore percentuale per lo standard (il 1 ° picco in questo caso, 26,666). 3. La colonna risultante dei valori è una misura della densità relativa di ogni picco, rispetto allo standard, che ovviamente hanno una densità relativa di 1. Figura 11. Calcolo densità relativa per ciascuno dei 4 picchi evidenziata. Usiamo Esempio 1 come standard per questo gel. La densità relativa è calcolato dividendo il valore percentuale per ogni campione per il valore percentuale per lo standard. 4. In questo esempio, il 2 ° corsia ha una densità maggiore relativa (1.86), che corrisponde bene con le dimensioni e l'oscurità di quella banda nell'immagine originale (Figura 1). Ricordiamo che questi dati sono per la riga superiore di bande sull'immagine Western Blot originale. 5. Se si desidera confrontare la densità dei campioni su più gel o macchie, sarà necessario utilizzare lo stesso campione di serie su tutti i gel per fornire un riferimento comune quando si calcolano i valori densità relativa. Vedere le sezioni di seguito per una discussione più dettagliata di questi requisiti. 6. Al fine di verificare le differenze significative tra i trattamenti in un esperimento, tutti i gel o macchie dovranno essere analizzati e quantificati con questo metodo, ed i valori saranno espressi in termini di densità relativa, oppure si può trattare Densità relativa come valore pieghevole cambio (cioè una differenza di densità relativa di 2 tra un controllo e trattamento indicherebbe un cambio 2 volte nell'espressione). Se si prevede di utilizzare l'analisi delle tecniche di varianza per verificare i dati, potrebbe essere necessario per assicurare che i valori di densità relativa sono distribuiti normalmente e che non vi è omogeneità della varianza tra i diversi trattamenti. 7. Si deve notare qui che alcuni ricercatori fanno lo sforzo supplementare per includere una serie di diluizioni seriali di uno standard noto su ogni blot. Utilizzando la curva di diluizione in serie e le tecniche di quantificazione di cui sopra, dovrebbe essere possibile esprimere le vostre band di esempio in termini di picogrammi o nanogrammi di proteina. Un esempio più coinvolto con carico-controlli. We8217ll utilizzare Figura 12 come Western Blot rappresentante. In questa macchia, noi far finta che abbiamo caricato di quattro repliche di campioni di proteine (quattro carichi pipetta dalla stessa fiala di omogenato), quindi ci aspettiamo le densità in ogni corsia per essere equivalente. La riga superiore del bar rappresenterà la nostra proteina di interesse. La serie inferiore di barre rappresenterà la nostra proteina di carico-controllo, che ha lo scopo di garantire che una pari quantità di proteine totali è stato caricato in ogni corsia. Questa proteina carico-controllo è una proteina che è presumibilmente espresso ad un livello costante indipendentemente dal trattamento applicato agli organismi originali, come actina (anche se molte persone in discussione l'affermazione che actina sarà espresso in modo equivalente attraverso trattamenti). Figura 12. Un Western Blot esempio con una fila inferiore di bande di carico-controllo. Spesso queste bande rappresenteranno una proteina che è pensato per essere espressa in modo equivalente in tutti i trattamenti, come ad esempio actina. Guardando Figura 12, avevamo sperato per caricare quantità equivalenti di proteine totali in ogni corsia, ma dopo aver eseguito il Western Blot, la dimensione e l'intensità delle barre inferiori in ogni corsia varia molto. Le due corsie di sinistra appaiono equivalenti, ma il 3 ° corsia ha la metà della densità (valore di grigio) rispetto a corsie 12, mentre corsia 4 ha la metà della densità e la metà delle dimensioni rispetto a corsie 12. Perché i nostri controlli di carico sono così diversi, la densità valori della serie superiore di bande non possono essere direttamente confrontabili. We8217ll usare ImageJ8217s gel analisi di routine per quantificare la densità e le dimensioni delle macchie, e utilizzare i risultati dei nostri controlli di carico-(bande inferiori) per scalare i valori per la nostra proteina di interesse (banda superiore). 1. Aprire l'immagine Western Blot in ImageJ. 2. Assicurarsi che l'immagine è in modalità a 8 bit: andare a ImagegtTypegt8 bit. 3. Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare una casella intorno a tutta la prima corsia (entrambe le barre superiori e inferiori inclusi. 4. Premere 822.018.221 (o Comando 1 su Mac) per impostare il rettangolo. A 822.018.221 dovrebbe apparire al centro del rettangolo. 5. Fare clic e tenere premuto il centro del rettangolo e trascinarlo nel corso del 2 ° corsia. 6. Premere 822.028.221 (comando 2 su Mac) per impostare il rettangolo di corsia 2. 822.028.221 dovrebbe apparire al centro del rettangolo. 7. Ripetere i passaggi 5 6 per ogni successivo corsia, premendo 822.028.221 (comando 2 su Mac) per impostare il rettangolo sopra ogni corsia successiva (vedi figura 13). Figura 13. ogni corsia è stata selezionata, spostando il rettangolo su di esso e premere 822.028.221 per impostare il rettangolo in atto. 8. Dopo aver effettuato l'ultima corsia (e pressato 822.028.221 per impostare in posizione), è possibile premere 822.038.221 per produrre un grafico delle corsie selezionati (vedi Figura 14). Figura 14. trama del profilo di ciascun corsia (organizzato con corsia 1 in alto, corsia 4 in basso). potrebbe essere necessario scorrere la finestra per vedere tutte le corsie. 9. La trama profilo rappresenta sostanzialmente il valore medio della densità attraverso un insieme di fette orizzontali di ogni corsia. macchie scure avranno picchi più alti, e le macchie che coprono una gamma di dimensioni più grandi (KD) avranno picchi più ampi. Nel nostro esempio Western Blot, le bande sono rettangoli perfetti, ma si noterà una certa pendenza nei picchi profilo trama, come ImageJ sta applicando un po 'di media dei valori di densità che si muove da cima a fondo di ogni corsia. As a result, the sharp transition from perfect white to perfect black on the bands of lane 1 is translated into a slight slope on the profile plot due to the averaging. 10. On our idealized western blot used here, there is no background noise, so the peak reaches all the way down to the baseline of the profile plot. In real western blots, there will be some background noise (the background will not be perfectly white), so the peaks won8217t reach the baseline of the profile plot (see figure 5 above). As a result, each plot will need to have a line drawn across the base of the peak to close it off. 11. Choose the Straight Line selection tool from the ImageJ toolbar. For each peak you want to analyze in the profile plot, draw a line across the base of the peak to enclose the peak (Figure 7). This step requires some subjective judgment on your part to decide where the peak ends and the background noise begins. 12. When each peak of interest is closed off with the straight line tool, switch to the Wand tool. We will use the wand tool to highlight each peak of interest so that Image-J can calculate its relative areadensity. 13. We will start by highlighting the loading-control bands (lower row) on our example western blot. Beginning at the top of the profile plot, use the wand to click inside the 1st peak (Figure 15). The peak should be highlighted after you click on it. Continue clicking on the loading-control peaks for the other lanes. If a lane is not visible at the bottom of the profile plot, hold down the space bar and click-and-drag the profile plot upwards to reveal the remaining lanes. Figure 15. Click inside the loading-control peak with the wand tool. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.
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